Experimento de transfección de Lentivirus

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Descripción general

El experimento de transfección de Lentivirus es una técnica que utiliza un vector de Lentivirus modificado para introducir genes exógenos de manera estable en la célula huésped. Los Lentivirus pertenecen a los retrovirus, tienen la capacidad de infectar células divididas y no divididas, pueden integrar genes objetivo en el genoma del huésped y lograr una expresión estable a largo plazo. Esta tecnología es ampliamente utilizada en la investigación de la función genética, la terapia génica y la preparación de células madre pluripotentes inducidas (células ips).

Detalles del producto

I,Experimento de transfección de LentivirusDefinición tecnológica y valores fundamentales

Transfección por LentivirusSe utiliza un vector de Lentivirus modificado para entregar genes exógenos a las células objetivo, lograndoExpresión estable a largo plazoTecnología de introducción genética. Sus ventajas básicas incluyen:

Aplicabilidad celular de amplio espectro: puede infectar células divididas y no divididas (como neuronas, células madre, células primarias) y romper las restricciones tradicionales de transfección.
Expresión integrada eficiente: El ARN viral se integra en el genoma del huésped después de ser transcrito al ADN para lograr la expresión duradera de Yong de genes exógenos.
Baja inmunogenicidad: eliminar los genes causantes del virus (como el vih)Tat,rev), reducir significativamente la respuesta inmune del huésped.
Facilidad de operación: no se necesitan reactivos de transfección complejos para infectar directamente las células a través de partículas virales.

Análisis de la terminología:

Transfección: generalmente se refiere a la introducción de ácidos nucleicos no mediados por virus (como electroperforación, lípidos).

Transducción: se refiere específicamente a la transmisión genética mediada por virus, y la tecnología de Lentivirus pertenece a esta categoría.

En segundo lugar,Experimento de transfección de LentivirusMecanismos moleculares: del embalaje viral a la integración genética

I) composición del sistema de vectores de Lentivirus

Componentes	función	Evolución tecnológica
Plasmídeo de transferencia	Llevar genes exógenos (como adnc, shrna) y señales de embalaje ()	Eliminación del portador de tercera generaciónTat, cambiando a la transcripción impulsada por el promotor CMV
Plásmido de embalaje	Expresión de proteínas estructurales virales (gag, pol)	Se divide en dos plásmidos Gag / POL y Rev para reducir el riesgo de recombinación.
Granos de proteínas envueltas	Expresión de la proteína VSV - G (proteína G del virus de la estomatitis bullosa) que determina el alcance del huésped	Reemplazar la envoltura natural del VIH y ampliar el tipo de células infectadas
Plasmídeo auxiliar	Proporciona proteínas Rev que promueven la exonucleosis del ARN no empalmado	Aumentar la producción de virus

(2) proceso de entrega genética dentro de la célula huésped

El virus entra: la proteína VSV - G se une a los receptores de membrana celular Diana (como ldlr), mediando la fusión de la membrana.
Retrotranscripción y nuclear: El ARN viral se transcribe a cDNA en el Citosol y se transfiere al núcleo a través del complejo preintegrado (pic).
Integración genómica: la integrasa viral (integra) inserta el adnc aleatoriamente en el cromosoma anfitrión para lograr la expresión duradera de yong.

III. procesos operativos estándar y optimización tecnológica

(1) embalaje y purificación del virus (tomando como ejemplo las células T 293)

pasos	Puntos clave de la operación	Normas de control de calidad
Co - transfección de plásmidos	El sistema de cuatro plásmidos (transferencia + embalaje + envoltura + asistencia) transfirió 293 células T y recogió el sobrenadante en 48 - 72 horas.	Pureza del plasmídeo > 1,8 (a260 / a280), sin LPS
Concentración del virus	Centrifugación por exceso de velocidad (50000 × g) o método de precipitación de peg, aumenta el título 10 - 100 veces	Título después de la concentración > 1 × 10 ifu / ML
Determinación del título	Citología de flujo (gen reportero fluorescente) o qpcr (número de copias del genoma viral)	Título funcional (tu / ml) > 10 es calificado

(2) transfección y selección de células Diana

Optimización de las condiciones de infección:

La adición de polybrene (8 μg / ml) mejora la adsorción del virus.
Prueba de Número complejo de infecciones (moi): generalmente Moi = 5 - 20 (ajustado por tipo de célula).

Selección de cepas estables:

Selección de antibióticos: la puromicina (1 μg / ml) se trató durante 7 - 14 días para eliminar las células no transfundidas.
Amplificación monoclonal: método de dilución limitada para obtener líneas celulares homogéneas.

Habilidades clave:

Las células no divididas (como las neuronas) necesitan prolongar el tiempo de infección a 72 horas.

Las células primarias recomiendan el uso de bajo Moi (≤ 5) para evitar la toxicidad.

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