Detección de células positivas de edición genética

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Descripción general

El cribado de células positivas de edición genética se refiere a la identificación y aislamiento de células que han sufrido con éxito modificaciones genéticas objetivo a través de métodos específicos después de experimentos de edición genética como crispr / cas9. Los métodos de detección comunes incluyen la detección de antibióticos (como el uso de marcadores genéticos resistentes), la detección de marcadores de proteínas fluorescentes, la PCR o la verificación de secuenciación. Este proceso es esencial para obtener líneas celulares mutantes homozigóticas o heterozigóticas, estudiar la función genética o construir modelos de enfermedad.

Detalles del producto

Detección de células positivas de edición genética: estrategias tecnológicas y procesos de optimización

La detección de células positivas es el eslabón central de la edición genética, y su eficiencia afecta directamente el ciclo experimental y la tasa de éxito.

I. objetivos y desafíos de selección

Objetivos básicos

Aislamiento de células editadas con éxito de poblaciones celulares mixtas (por ejemplo, knock - off / ko, knock - in / ki).
Se descarta la interferencia de células de tipo salvaje (cuando la proporción de células no editadas es alta, es fácil causar falsos negativos).

Desafíos clave

Daño celular: la detección a largo plazo conduce al envejecimiento celular (la capacidad de proliferación de los fibrocitos porcinos disminuye bruscamente después de la transmisión).
Riesgo de falsos positivos: edición parcial sin Wan destruyendo completamente la función genética (por ejemplo, la mutación de cambio de código no causó pérdida de función).
Cuello de botella de flujo: el cultivo monoclonal tradicional tarda más de 22 días y la tasa positiva es inferior al 20%.

2. las principales tecnologías de selección y procesos operativos

I) tecnologías de enriquecimiento basadas en sistemas de presentación de informes

El uso de mecanismos de reparación para desencadenar la expresión de Marcadores fluorescentes / resistentes permite la visualización y la clasificación rápida:

Mecanismo de reparación	Diseño del sistema de informes	Método de selección	ventaja	Casos
número	Destrucción dirigida de terminadores de proteínas fluorescentes → recuperación de la expresión	FACS clasifica células GFP	Intuitivo y eficiente, adecuado para Ko	Portador crispr - DIY
HDR	Recombinación homóloga para insertar genes resistentes (como puro)	Selección de presión antibiótica	Adecuado para ki, bajo costo	Plasmídeo crispr de biyuntian
SSA	Reparación de recocido de cadena única inducida por la rotura → reconstrucción de proteínas fluorescentes	Citología de flujo	Alta sensibilidad y baja tasa de pérdida de objetivos	Verificación de edición genética múltiple

Proceso de operación(tomemos como ejemplo el sistema nhej - gfp):

Construir conTerminator GFP - taaEl vector de Edición (sgrna apunta a la región taa).

Después de la transfección de la célula, el nhej repara el terminador de destrucción → expresión de gfp.

Uso después de 72 horasMedidor de flujo (como ike) ®） Clasificación de células GFP.

(2) método de identificación rápida de células trazas

Programa innovador: solo se necesitan 50 células para completar la identificación del genotipo y acortar el ciclo en más de 15 días.

Parámetros clave:

Cantidad celular: ≥ 50 (la tasa de detección del Grupo de 20 células es insuficiente, p < 0,01).
Sensibilidad de la enzima: t7e1 puede detectar una eficiencia editorial ≥ 5%.
Pasos de verificación: la secuenciación de Sanger confirma el tipo de mutación (por ejemplo, inserción / ausencia).

(3) técnicas de verificación de enzima y secuenciación

Método	Principio	Escenarios de aplicación	Limitaciones
Enzima t7e1	El Corte desajuste produce cadenas dobles heterogéneas	Cribado primario (bajo costo)	Baja sensibilidad (≥ 5% tasa de edición)
Secuenciación de Sanger	Lectura directa de la mutación de la secuencia	Verificación monoclonal	Bajo flujo
Secuenciación de alto rendimiento	Mutación del objetivo de cobertura profunda	Análisis multigenético / Diana	成本高

Optimización operativa:

Cribado clonal mixto: fa - PCR detecta la tasa de edición del Grupo y luego clasifica los clones individuales cuando es superior al 30%.

Estrategia de doble verificación: clonación positiva de detección primaria t7e1 → confirmación de secuenciación de Sanger (evitar falsos positivos).

3. selección de tecnología y adaptación de escenarios

I) selección por tipo de célula

Tipo de célula	Método recomendado	Razones
Células primarias	Método de identificación de células trazas	Evitar el envejecimiento causado por el cultivo a largo plazo (fibrocitos porcinos)
Línea celular tumoral	Selección de antibióticos + FACS	Proliferación rápida y resistencia estable a los medicamentos
iPSCs	Sistema de notificación HDR + secuenciación monoclonal	Mantener la versatilidad requiere edición de alta precisión

(2) selección por tipo de edición

Tipo de edición	Tecnología de selección	Indicadores clave
Golpe genético (ko)	Sistema de presentación de informes nhej - GFP	Proporción de células GFP (cuantificación por flujo)
Entrada genética (ki)	Selección de antibióticos + verificación PCR	Tasa de supervivencia de la resistencia + amplificación de la secuencia lateral
Mutación puntual (pm)	T7e1 + secuenciación profunda	Frecuencia de mutación superior al 90%

Detección de células positivas de edición genética

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