Células endoteliales microvasculares de la retina humana

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El epitelio microvascular de la retina humana separa el tejido de la retina autovisual; La retina se encuentra en la capa interna de la pared del globo ocular y es una película transparente. La retina está compuesta por una capa epitelial pigmentaria y una capa sensorial de la retina, que se puede separar en condiciones patológicas, llamada desprendimiento de retina. La capa del epitelio pigmentario está estrechamente vinculada a la coroidea y está compuesta por células del epitelio pigmentario, que tienen los efectos de apoyar y nutrir las células receptoras de luz, sombrear, disipar el calor y regenerar y reparar. Históricamente, la retina se divide en10 capas, de afuera a adentro, son: capa epitelial pigmentaria, cono óptico, capa celular del tronco óptico, membrana externa, capa de partículas externas, capa de partículas externas, capa de partículas internas, capa de células ganglión, capa de fibras nerviosas y membrana límite interna. La capa interna de la retina es una película delgada forrada en la superficie interna de la membrana vascular, que tiene un efecto fotosensible; Hay un papila del nervio óptico en la parte posterior de la nariz. La capa sensorial en la retina está compuesta por tres neuronas. Las neuronas son capas de células ópticas, especializadas en la sensibilidad a la luz, que incluyen conos y células de barra. Las células del poste óptico se encuentran principalmente en la retina lejos del cóncavo central, mientras que las células del Cono óptico son las más numerosas en el Cóncavo central. La segunda capa se llama células de doble nodo, y alrededor de 10 a cientos de células ópticas se asocian con una célula de ganglios a través de células de doble nodo, que son responsables de la acción de enlace. La tercera capa se llama capa celular de ganglios, que se especializa en la conducción. La retina es una estructura delgada pero muy compleja que se adhiere a la pared posterior del globo ocular, y las fibras nerviosas que transmiten los impulsos de los receptores de la retina cruzan la superficie de la retina y llegan a la salida a través del nervio óptico. La resolución de la retina es desigual, y en la zona macular, su capacidad de resolución es Fuerte. Es una célula epidémica plana de una sola capa que constituye la superficie de la cavidad vascular. las sustancias bioactivas que produce y secreta juegan un papel importante en el mantenimiento de la tensión vascular, la regulación de la presión arterial y la antitrombótica, y tienen una importancia fisiopatológica importante en la patogénesis de la enfermedad vascular retiniana. Debido a las diferentes características de las células endoteliales obtenidas de diferentes tejidos y órganos, en el cerebro y la retina, estas células endoteliales tienen la función de barrera interna y juegan un papel importante en la regulación del estado fisiológico vascular, la liberación de sustancias vasoactivas y la formación de nuevos vasos sanguíneos. el cultivo aislado in vitro de rcec es de gran importancia clínica para el estudio de los mecanismos fisiopatológicos de la aparición y desarrollo de enfermedades vasculares retinianas y la prevención y el tratamiento tempranos de la enfermedad.
Introducción al método:

El epitelio microvascular de la retina humana aislado por el laboratorio de la compañía utiliza colagenasa¿- digestión mixta de la enzima dan neutra combinada con el método de centrifugación de gradiente de densidad y finalmente preparada a través de la selección de cultivo de medios especiales para células endoteliales, ¿ el número total de células es de aproximadamente 5 × 10? Cells / botella.
Pruebas de calidad:

El meridiano endoteliales microvasculares de la retina humana aislado por el laboratorio de la empresaLa identificación de inmunofluorescencia cd31 puede alcanzar una pureza de más del 90% y no contiene VIH - 1, hepatitis b, hepatitis c, micoplasma, bacterias, levadura y hongos.

Condiciones del sobre PLL（0.1mg/ml）， Gelatina (0,1%)

Medio de cultivo IncluyendoFBS、 Aditivos para el crecimiento, pencilina, streptomicina, etc.

Frecuencia de cambio de líquido CadaCambio de líquido una vez cada 2 - 3 días

Características de crecimiento Pegar a la pared

Morfología celular Tipo de células endoteliales

Características generacionales Se puede transmitirGeneración 2 - 3

Líquido digestivo 0,25% proteasa Yi

Condiciones de cultivo Fase gaseosa: aire,95%； CO2, 5%

Preparativos

1. preparación de equipos experimentales: preparación de placas de Petri estériles, botellas de cultivo, pipetas, tubos centrífuga, instrumentos quirúrgicos, etc., y esterilización a alta presión u otros tratamientos de desinfección adecuados.

2. preparación de reactivos: preparar o comprar medios de cultivo adecuados, enzimas digestivas (por ejemplo, colagenasa, etc.), suero bovino fetal, doble anticuerpo, etc., para garantizar que sea estéril y durante la vida útil.

3. preparación del animal experimental o del origen del tejido: seleccionar el animal adecuado y realizar la anestesia o ejecución correspondiente de acuerdo con las necesidades del experimento para obtener el tejido necesario; O obtener la Organización de una base de datos de muestras de organización existente.

Extracción y tratamiento de materiales

1. extracción de materiales: en condiciones estériles, extraer rápidamente el tejido objetivo, minimizar el daño al tejido y eliminar el exceso de grasa, tejido conjuntivo y otros tejidos no objetivo.

2. limpieza: lavar el tejido extraído varias veces con un PBS estéril preconfriado para eliminar la sangre y las impurezas.

3. corte: Corte el tejido en trozos pequeños de aproximadamente 1 - 2 mm3 para su posterior digestión.

Aislamiento celular

1. digestión: coloque los bloques de tejido cortados en un tubo centrífuga que contenga una cantidad adecuada de enzimas digestivas y digiera en un sacudidor a temperatura constante de 37 ° c o en una incubadora durante un período de tiempo. Durante este período, el tubo centrífuga se puede sacudir suavemente para hacer que la digestión sea más uniforme.

2. terminar la digestión: cuando la mayor parte de los bloques de tejido se digieren en suspensión unicelular o pequeñas masas celulares, se añade un medio que contiene suero para terminar la digestión.

3. filtración y centrifugación: filtrar la suspensión celular con un tamiz celular, eliminar los fragmentos de tejido no digeridos y luego centrifugar el filtrado a la velocidad adecuada para recoger la precipitación celular.

Observación y detección celular

1. observación diaria: observar la morfología, el Estado de crecimiento, la densidad de las células con un microscopio invertido todos los días, registrar los cambios en las células, si se encuentra contaminación celular o anomalías, tomar las medidas correspondientes a tiempo.
2. recuento celular y detección de vitalidad: cuando sea necesario, las células se pueden contar y detectar de vitalidad mediante métodos como la tinción azul de esperanza para comprender el crecimiento celular y el Estado de salud.

I. extracción y separación de materiales

1. operación rápida

Los tejidos deben tratarse inmediatamente después de la extracción para evitar la exposición prolongada a la temperatura ambiente o a entornos no nutritivos.

Lavar los tejidos con PBS estériles o solución salina normal para eliminar la sangre y las impurezas.

2. selección de enzimas digestivas

- selección de enzimas digestivas en función del tipo de tejido para evitar el daño celular causado por la sobredigestión.

El tiempo de digestión debe controlarse estrictamente (generalmente 10 - 30 minutos) y el Estado de desconexión celular se puede observar mediante un microscopio.

II. optimización de las condiciones de cultivo

1. selección de medios de cultivo

- utilizar medios que contengan suero o factores de crecimiento específicos (como dmem, rpmi 1640, etc.), algunas células deben agregar insulina, egf, etc.

Evitar cambios frecuentes de marcas o lotes de medios de cultivo y reducir el estrés de adaptación celular.

2. pegarse a la pared y pasar de generación en generación

- las células primarias tienen una capacidad débil para adherirse a la pared y pueden necesitar ser envueltas en placas de Petri (como colágeno, polilisina).

- se recomienda controlar la densidad entre el 70% y el 80% durante el paso, y la confluencia excesiva puede conducir a la inhibición y diferenciación del contacto.

III. control de la contaminación

1. operación estéril

Operar todo el proceso en la Mesa súper limpia, utilizando consumibles desechables para evitar la contaminación cruzada.

- se puede añadir doble resistencia al medio de cultivo, pero el uso a largo plazo puede afectar la actividad celular.

2. detección de micoplasma

Detectar regularmente la contaminación por micoplasma (como el método pcr) y descartar las células a tiempo después de la contaminación.

IV. vigilancia del Estado

1. observación diaria

- Revisar diariamente la morfología celular, la densidad y el color del medio de cultivo y cambiar el medio de cultivo a tiempo (generalmente cada 2 - 3 días).

La morfología anormal (como redondeo celular y aumento de fragmentos) puede indicar contaminación o desnutrición.

2. transmisión y almacenamiento congelado

El número de divisiones celulares primarias es limitado (generalmente de 5 a 10 generaciones), y es necesario congelar las células secundarias tempranas a tiempo.

- se recomienda el uso de suero Dmso + (o medio especial de criopreservación) para el liofilizado, que se conserva con nitrógeno líquido después de enfriarse por gradiente.