Células endoteliales microvasculares pulmonares humanas

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El epitelio microvascular pulmonar humano se separa del tejido pulmonar; Los pulmones son los órganos respiratorios del cuerpo, ubicados en la cavidad torácica, uno a la izquierda y otro a la derecha, que cubren el corazón. Los pulmones tienen lóbulos divididos, dos a la izquierda y tres a la derecha, un total de cinco lóbulos. El sistema pulmonar meridiano (refiriéndose a la tráquea, bronquios, etc.) está conectado con la garganta y la nariz, por lo que la garganta se llama la puerta de entrada de los pulmones y la nariz es un agujero extrapulmonar. Las células endoteliales microvasculares están estrechamente involucradas en una serie de respuestas fisiológicas e inflamatorias, incluyendo regeneración, desarrollo y curación de heridas. Las células son en forma de fusiforme o poliángulos, dispuestas en forma de Guijarro o piedra pavimentada después de formar una sola capa. Las células endoteliales microvasculares pulmonares constituyen una barrera semiselectiva que es de gran importancia para el intercambio de gases pulmonares y para regular el flujo de líquidos y sustancias solubles entre la sangre y el estroma pulmonar.

Introducción al método:

El epitelio microvascular pulmonar humano aislado en el laboratorio se preparó mediante el método de adhesión de tejido y el cultivo y cribado de medios de cultivo especiales para células endoteliales, con un total de aproximadamente 5 × 10 células / botella.

Pruebas de calidad:

El epitelio microvascular pulmonar humano aislado en el laboratorio fue identificado por inmunofluorescencia cd31, con una pureza de más del 90%, y no contiene VIH - 1, hepatitis b, hepatitis c, micoplasma, bacterias, levadura y hongos.

Condiciones del sobrePll (0,1 mg / ml) o gelatina (0,1%)

Medio de cultivoContiene fbs, aditivos para el crecimiento, pencilina, streptomicina, etc.

Frecuencia de cambio de líquidoCambiar de líquido cada 2 - 3 días

Características de crecimientoPegar a la pared

Morfología celularTipo de células endoteliales

Características generacionalesSe puede transmitir de 2 a 3 generaciones

Líquido digestivo0,25%

Preparativos

1. preparación de equipos experimentales: preparación de placas de Petri estériles, botellas de cultivo, pipetas, tubos centrífuga, instrumentos quirúrgicos, etc., y esterilización a alta presión u otros tratamientos de desinfección adecuados.

2. preparación de reactivos: preparar o comprar medios de cultivo adecuados, enzimas digestivas (por ejemplo, colagenasa, etc.), suero bovino fetal, doble anticuerpo, etc., para garantizar que sea estéril y durante la vida útil.

3. preparación del animal experimental o del origen del tejido: seleccionar el animal adecuado y realizar la anestesia o ejecución correspondiente de acuerdo con las necesidades del experimento para obtener el tejido necesario; O obtener la Organización de una base de datos de muestras de organización existente.

Extracción y tratamiento de materiales

1. extracción de materiales: en condiciones estériles, extraer rápidamente el tejido objetivo, minimizar el daño al tejido y eliminar el exceso de grasa, tejido conjuntivo y otros tejidos no objetivo.

2. limpieza: lavar el tejido extraído varias veces con un PBS estéril preconfriado para eliminar la sangre y las impurezas.

3. corte: Corte el tejido en trozos pequeños de aproximadamente 1 - 2 mm3 para su posterior digestión.

Aislamiento celular

1. digestión: coloque los bloques de tejido cortados en un tubo centrífuga que contenga una cantidad adecuada de enzimas digestivas y digiera en un sacudidor a temperatura constante de 37 ° c o en una incubadora durante un período de tiempo. Durante este período, el tubo centrífuga se puede sacudir suavemente para hacer que la digestión sea más uniforme.

2. terminar la digestión: cuando la mayor parte de los bloques de tejido se digieren en suspensión unicelular o pequeñas masas celulares, se añade un medio que contiene suero para terminar la digestión.

3. filtración y centrifugación: filtrar la suspensión celular con un tamiz celular, eliminar los fragmentos de tejido no digeridos y luego centrifugar el filtrado a la velocidad adecuada para recoger la precipitación celular.

Observación y detección celular

1. observación diaria: observar la morfología, el Estado de crecimiento, la densidad de las células con un microscopio invertido todos los días, registrar los cambios en las células, si se encuentra contaminación celular o anomalías, tomar las medidas correspondientes a tiempo.
2. recuento celular y detección de vitalidad: cuando sea necesario, las células se pueden contar y detectar de vitalidad mediante métodos como la tinción azul de esperanza para comprender el crecimiento celular y el Estado de salud.

I. extracción y separación de materiales

1. operación rápida

Los tejidos deben tratarse inmediatamente después de la extracción para evitar la exposición prolongada a la temperatura ambiente o a entornos no nutritivos.

Lavar los tejidos con PBS estériles o solución salina normal para eliminar la sangre y las impurezas.

2. selección de enzimas digestivas

- selección de enzimas digestivas en función del tipo de tejido para evitar el daño celular causado por la sobredigestión.

El tiempo de digestión debe controlarse estrictamente (generalmente 10 - 30 minutos) y el Estado de desconexión celular se puede observar mediante un microscopio.

II. optimización de las condiciones de cultivo

1. selección de medios de cultivo

- utilizar medios que contengan suero o factores de crecimiento específicos (como dmem, rpmi 1640, etc.), algunas células deben agregar insulina, egf, etc.

Evitar cambios frecuentes de marcas o lotes de medios de cultivo y reducir el estrés de adaptación celular.

2. pegarse a la pared y pasar de generación en generación

- las células primarias tienen una capacidad débil para adherirse a la pared y pueden necesitar ser envueltas en placas de Petri (como colágeno, polilisina).

- se recomienda controlar la densidad entre el 70% y el 80% durante el paso, y la confluencia excesiva puede conducir a la inhibición y diferenciación del contacto.

III. control de la contaminación

1. operación estéril

Operar todo el proceso en la Mesa súper limpia, utilizando consumibles desechables para evitar la contaminación cruzada.

- se puede añadir doble resistencia al medio de cultivo, pero el uso a largo plazo puede afectar la actividad celular.

2. detección de micoplasma

Detectar regularmente la contaminación por micoplasma (como el método pcr) y descartar las células a tiempo después de la contaminación.

IV. vigilancia del Estado

1. observación diaria

- Revisar diariamente la morfología celular, la densidad y el color del medio de cultivo y cambiar el medio de cultivo a tiempo (generalmente cada 2 - 3 días).

La morfología anormal (como redondeo celular y aumento de fragmentos) puede indicar contaminación o desnutrición.

2. transmisión y almacenamiento congelado

El número de divisiones celulares primarias es limitado (generalmente de 5 a 10 generaciones), y es necesario congelar las células secundarias tempranas a tiempo.

- se recomienda el uso de suero Dmso + (o medio especial de criopreservación) para el liofilizado, que se conserva con nitrógeno líquido después de enfriarse por gradiente.