Medio de cultivo especial para células musculares lisas aórticas torácicas primarias de ratas

Puntos clave de la operación:

Pasos de cultivo celular:

I. preparación de los medios de cultivo y las condiciones de congelación del cultivo:

1) preparar el medio de cultivo dmem - H (añadir NaHCO3 1,5g / l), 90%; Suero bovino fetal, 10%. También se puede seleccionar un medio de suspensión de acuerdo con las necesidades del experimento para que las células T 293 crezcan en suspensión.

2) condiciones de cultivo: fase gaseosa: aire, 95%; Dióxido de carbono, 5%. Temperatura: 37 grados centígrados, humedad de la incubadora del 70% al 80%.

3) liofilizado: 90% medio de cultivo, 10% dmso, listo para usar. Almacenamiento de nitrógeno líquido.

II. tratamiento celular:

1) células de reanimación: agitar y descongelar rápidamente el criodepósito que contiene 1 ml de suspensión celular en un baño de agua a 37 ° c, añadir 4 ml de medio de cultivo y mezclar uniformemente. Centrifugar durante 4 minutos a 1000 rpm, descartar el líquido sobrenadante, añadir 1 - 2 ml de medio de cultivo y soplar bien. A continuación, se añaden todas las suspensiones celulares al frasco de cultivo durante la noche (o se añade la suspensión celular a una placa de Petri de 10 cm, se añaden unos 8 ml del medio de cultivo y se cultiva durante la noche). Al día siguiente, cambie de líquido y compruebe la densidad celular.

2) transmisión celular: si la densidad celular alcanza el 80% - 90%, se puede realizar el cultivo de transmisión.

Para las células adherentes, la transmisión puede referirse a los siguientes métodos:

1. abandone el sobrenadante de cultivo y lave las células 1 - 2 veces con PBS sin iones de calcio y magnesio.

2. añadir 2 ml de líquido digestivo (0,25% TRYPSIN - 0,53 mm edta) en el frasco de cultivo, colocarlo en una incubadora a 37 ° C para digerir durante 1 - 2 minutos, y luego observar la digestión celular bajo un microscopio, si la mayoría de las células se redondean y se caen, llevarlo rápidamente de vuelta a la Mesa de operaciones, golpear ligeramente el frasco de cultivo y añadir una pequeña cantidad de medio de cultivo para terminar la digestión.

3. presione 6 - 8 ml / botella para complementar el medio de cultivo, revuelva suavemente y exprima, centrifuga durante 4 minutos en condiciones de 1000rpm, abandone el sobrenadante, agregue 1 - 2ml de medio de cultivo y sople bien.

4. dividir la suspensión celular en una nueva placa de Petri o botella que contenga 8 ml de medio de cultivo en una proporción de 1: 2 a 1: 5.

3) Criopreservación celular: cuando la célula está en buen estado de crecimiento, se puede congelar la célula. Cuando las células adheridas se congelan, se agrega una pequeña cantidad después de descartar el medio de cultivo. después de que las células se redondean y se desprenden, se agregan unos 1 ml de medio de cultivo que contiene suero y se agregan al criopreservación. después de agregar un 10% de dmso, se congela.

¿¿ el método de Criopreservación de las células?

Método de congelación y conservación 1: el tubo de congelación se coloca a 4 ° C durante 30 a 60 minutos → (- 20 ° C durante 30 minutos *) → - 80 ° C durante 16 a 18 horas (o durante la noche) → almacenamiento a largo plazo de vaporphase en tanque de nitrógeno líquido.

Método de congelación y conservación 2: el tubo de congelación se coloca en una máquina de enfriamiento programable con un programa establecido para bajar de 1 - 3 ° C a menos de - 80 ° C por minuto, y luego se coloca en un tanque de nitrógeno líquido vaper fase para su almacenamiento a largo plazo. No más de una hora a - 20 ° C para evitar que los cristales de hielo sean demasiado grandes y causen una gran cantidad de muertes celulares, también se puede saltar este paso y ponerlo directamente en el refrigerador a - 80 ° c, pero la tasa de supervivencia se reduce ligeramente.