Kit de Apoptosis celular fitc - annexin V / PI

Kit de Apoptosis celular fitc - annexin V / PI

Número del producto:F6012L

Especificaciones del producto:100T

Condiciones de almacenamiento:

4℃Conservar en frío para evitar la luz, no congelar.La fecha de caducidad se ve en el embalaje exterior..

Características espectrales:

FITC-Anexina V: Ex/Em = 494/518 nm

PI: Ex/Em = 535/617 nm (con ADN)

Introducción del producto:

FITC-Anexina V/PILos kits apoptóticos proporcionan una forma rápida y sencilla de marcar células apoptóticas tempranas (verdes) y células necróticas o apoptóticas avanzadas(rojo) detecta el nivel de apoptosis celular. El producto se puede detectar con un medidor de flujo u otro equipo de detección fluorescente.

Anexo V(proteína de unión a la membranade V) es un peso molecular de35-36KDDeCa2 +Proteína de Unión fosfolípida dependiente, disponible en fosfolípidos..PS) Unión selectiva.Fosfolípidos..PS) se distribuye principalmente en el interior de la membrana celular, es decir, en el lado adyacente al plasma celular. En las primeras etapas de la apoptosis celular, diferentes tipos de células convierten los FosfolípidosEl acilo se volcó en la superficie celular y se expuso a un entorno extracelular. En este momento, se utiliza una sonda fluorescente verdeFITCMarcadoAnexo V, es decirFITC - Anexo V，Fosfolípidos con valgus..PS) en combinación, se puede detectar directamente la valgus de Fosfolípidos con un citometro de flujo o un microscopio fluorescente, una característica importante de la apoptosis celular.Zheng. Para las células necróticas o apoptóticas avanzadas, debido a que la integridad celular ha sido destruida,FITC - Anexo VPor su parte, se puede entrar en el plasma y en el interior de la capa fosfolípida.PSLa Unión también hace que las células necróticas muestren fluorescencia Verde.

Yoduro de propidinaYoduro de propio, PI) es unaADNSe une al tinte que puede teñir las células necróticas o las células con Apoptosis avanzada que pierden la integridad de la membrana celular.Núcleo celular.PIPuede ser488、532 O546 nmEstimulado por láser, muestra fluorescencia roja.

Método de uso:

1. diseño experimental:

Tubo en blanco: células del Grupo de control negativo, sin añadirFITC-Anexina V/PI. para ajustar el voltaje.

Tubo monocromático: células del Grupo de control positivo, solo añadidasFITC-Anexo V/Solo másPI. para ajustar la compensación.

Tubo de detección: células tratadas, másFITC-Anexina V/PI. después de ajustar la compensación de voltaje con un tubo en blanco y un tubo de teñido único, se obtienen los datos de flujo necesarios.

2. recogida de células:

(1) para las células suspendidas:

a.Después de la estimulación de la apoptosis celular,1000 rpmCentrifugadora5 minutos, abandonar el sobrenadante, recoger células, usarPBSVuelva a colgar suavemente las células y cuente. Nota:PBSLa suspensión pesada no se puede omitir,PBSEl proceso de suspensión pesada también sirve para lavar las células, lo que puede garantizar el seguimiento.FITC-Anexo VLa combinación.

b.取5 × 104 - 1 × 105Una célula en suspensión pesada,1000 rpmCentrifugadora5 minutosAbandonar shangqing y unirse100 ul 1 x Anexina VEn combinación con el amortiguador, las células se resuelven suavemente.

c.Unirse5 µL de FITC-Anexina VMezcle suavemente.

d.Unirse5 uL de PISolución de teñido, mezclar suavemente.

e.Temperatura ambiente(20-25ºC)Eclosión para evitar la luz10 - 15 minutos. Se puede usar papel de aluminio para evitar la luz. Las células se pueden volver a colgar durante la incubación.2 - 3Dos veces para mejorar el efecto de teñido.

(2) para las células adherentes:

a.Aspirar el medio de cultivo celular en un tubo centrífuga adecuado,PBSLavar las células adheridas una vez y añadir una cantidad adecuada de líquido digestivo celular(sinEDTA)Células digestivas. Incubar a temperatura ambiente hasta soplar suavemente puede hacer que las células adherentes absorban el líquido digestivo celular cuando se soplan. Sobredigestión que hay que evitar. Nota: para las células adherentes, los pasos digestivos son clave. Si el tiempo de digestión es demasiado corto, la célula necesita soplar con fuerza para desprenderse, lo que puede causar fácilmente daños en la membrana celular, lo que conduce a falsos positivos en la necrosis celular; Si el tiempo de digestión es demasiado largo, también es fácil causar daño a la membrana celular y aparecer falsos positivos de necrosis celular, e incluso puede afectar el fosfonilo y el ácido fosfórico en la membrana celular.FITC-Anexo VLa Unión interfiere así con la detección de la apoptosis celular.

b.Añadir el medio de cultivo celular recogido en el paso anterior, soplar suavemente la célula y transferirla al tubo centrífuga,1000 rpmCentrifugadora5 minutos, abandonar el sobrenadante, recoger células, usarPBSVuelva a colgar suavemente las células y cuente. Nota: es muy importante agregar el medio de cultivo celular en el paso anterior, por un lado, que puede recoger células que han sido suspendidas para la apoptosis o necrosis, y por otro lado, el suero en el medio de cultivo celular puede inhibir o neutralizar eficazmente los residuos. Los residuos digerirán y degradarán las adiciones posteriores.FITC-Anexo V, lo que resulta en un fracaso de teñido.

c.取5 × 104 - 1 × 105Una célula en suspensión pesada,1000 rpmCentrifugadora5 minutosAbandonar shangqing y unirse100 ul 1 x Anexina VEn combinación con el amortiguador, las células se resuelven suavemente.

d.Unirse5 µL de FITC-Anexina VMezcle suavemente.

e.Unirse5 uL de PISolución de teñido, mezclar suavemente.

f.Temperatura ambiente(20-25ºC)Eclosión para evitar la luz10 - 15 minutos. Se puede usar papel de aluminio para evitar la luz. Las células se pueden volver a colgar durante la incubación.2 - 3Dos veces para mejorar el efecto de teñido.

3. análisis de los resultados:

(1) detección por citometro de flujo:

A. una vez finalizada la incubación, se pueden agregar directamente 400 μl 1 × annexin V a las células de suspensión de tampón de unión, que se pueden detectar inmediatamente en la máquina. fitc - annexin V está estimulado por un láser de 488 nm, y el espectro de emisión de fluorescencia de detección es de 530 nm (canal fitc), y el espectro de emisión del canal Pi es de aproximadamente 617 nm.

B. en el mapa de dispersión del citometro de flujo bivariable, el cuadrante inferior izquierdo muestra células vivas, que es (fitc - annexin V - / PI -); El cuadrante inferior derecho es una célula apoptótica temprana, que es (fitchanexin v + / PI -); El cuadrante superior derecho es una célula necrótica y apoptótica avanzada, que es (fitc - annexin v + / PI +); El cuadrante superior izquierdo muestra células nucleares desnudas, que es (fitc - annexin V - / PI +).

(2) detección por microscopio fluorescente:

A. centrifugar 1000 RPM durante 5 minutos, recoger las células y volver a colgarlas suavemente con 400 μl de 1 × annexin V combinada con un amortiguador. Después de mover la célula a una placa de 96 agujeros para asentarse por un momento o realizar un frotis celular, se observó bajo un microscopio fluorescente.

B. fitc - annexin V se puede utilizar como filtro aplicable a fitc, Pi se puede utilizar como filtro aplicable a cy3 o texas.

Precauciones:

1. Antes de usarlo, centrifugar instantáneamente el producto hasta el Fondo del tubo antes de realizar experimentos posteriores.

2. Para reducir el proceso de apoptosis celular, el proceso de incubación se puede operar sobre hielo, pero el tiempo de incubación se extiende al menos hasta30 minutos.

3. Debido a que la apoptosis celular es un proceso rápido, se recomienda que las muestras se teñen después.1 horaAnálisis interno.

4. Para las células adherentes, la digestión es un paso clave. Si hay células flotantes cuando las células adherentes inducen la apoptosis, es necesario recoger células flotantes y células adherentes y fusionarlas para teñirlas. Trate las células adheridas con cuidado y trate de evitar dañar las células artificialmente. El tiempo de digestión es demasiado corto, las células necesitan soplar con fuerza para desprenderse, lo que puede causar fácilmente daños en la membrana celular.PIIngesta excesiva; El tiempo de digestión es demasiado largo, y la membrana celular también es fácil de causar daños, e incluso puede afectar el Fosfolípido y el ácido fosfórico en la membrana celular.FITC-Anexo VUnión. Al digerir, se cubrirá el Fondo del foramen, se tocará completamente con la célula al Sacudirlo ligeramente, luego se tirará la mayor parte, se utilizará la pequeña cantidad restante para digerir durante un período de tiempo, y se puede terminar cuando el hueco entre las células aumente y el Fondo de la botella esté en forma de manchas de flores. Trate de no usarlo en el líquido digestivo.EDTA,EDTAAfectaráAnexo VConPSLa combinación.

5. Después de la digestión de las células adherentes, se recomienda recuperarse en condiciones y medios de cultivo.30 minutosTeñir después y evitar falsos positivos.

6. Para evitar la pérdida de células al lavar las células, se pueden usar grandesConsejosCapucha pequeñaConsejosSucción de cabeza.

7. La concentración de uso de los tintes se determina por los requisitos experimentales específicos.

8. Los tintes fluorescentes tienen problemas de enfriamiento, por favor, trate de evitar la luz durante la conservación y el uso para ralentizar el enfriamiento fluorescente.

9. Para su seguridad y salud, Use ropa experimental y guantes desechables.