Clonación y análisis de expresión de células receptoras de transferencia eléctrica de Agrobacterium

EHA105(pSoup) Célula Electrocompetente

Células receptoras de conversión eléctrica de Agrobacterium

Etiqueta del producto:

CEPA eha105; Células receptoras de agrobacterium; Rifampicin (rif) rifupina; Kanamycin (kan) kanamei vegetarian; EHA101； LBA4404； GV3101； AGL1； Investigación sobre transgénicos vegetales;

Pedidos de productos:Mayores problemas técnicos de embalaje o producto,

Descripción del producto:

La CEPA eha105 fue modificada por la CEPA eha101, con un fondo cromosómico de c58 y un gen nuclear con una etiqueta de selección - rif, un gen resistente a la rif. para facilitar la operación de transformación, esta cepa lleva un plasmídeo ti ámbar pheha105 (ptibo542dt - adn) sin su propia función de transporte. este plasmídeo contiene el gen vir (el gen vir Es un elemento necesario para la inserción de T - ADN en el genoma de la planta. aunque la función de transferencia de T - ADN del propio plasmídeo pheha105 (ptibo542dt - adn) está destruida, puede ayudar a la transferencia sin problemas del vector dual T - ADN transferido). Se transfirió al plasmídeo help en la CEPA eha105: psoup, es decir, se obtuvo la CEPA eha105 (psoup), que puede ayudar a replicar los plasmídeos de las series pgreen, 62sk y pgs2 en agrobacterium, al tiempo que se le dio resistencia a la tetraciclina (tetr), adecuada para operaciones transgénicas en plantas como el arroz y el Tabaco.

Las células electroreceptivas eha105 (psoup) proporcionadas por nuestra empresa (maokang biology) se elaboran a través de un proceso especial, que es especialmente adecuado para la transformación de grandes plásmidos. El genotipo es c58 (rifr) ti pheha105 (psoup) (ptibo542dt - adn) succinamopine (psoup - tetr), y la eficiencia de conversión es superior a 105cfu / μg de ADN después de la detección del Plásmido pgs2.

Componentes del producto:

Condiciones de conservación y transporte:

Conservación: - 80 ° c conservación, efectiva durante 1 año.

Transporte: transporte de hielo seco.

Precauciones

1) las células receptivas deben conservarse a - 80 ° C y no deben congelarse, descongelarse y colocarse repetidamente durante demasiado tiempo para no reducir la eficiencia de transformación de las células receptivas.

2) toda la operación de conversión se realiza estrictamente de acuerdo con los requisitos de temperatura y condiciones estériles correspondientes.

3) el volumen de adición del Plásmido no debe ser mayor que 1 / 10 del volumen receptivo. Los plásmidos impuros o la presencia de contaminación orgánica como el etanol pueden conducir a una fuerte disminución de la eficiencia de conversión. El Plásmido se duplicó y la eficiencia de transformación disminuyó en un orden de magnitud.

4) para garantizar la alta eficiencia de conversión de zui, todo el proceso de operación debe ser lo más suave posible y mantener bajas temperaturas.

5) la transformación de plásmidos de alta concentración puede reducir la cantidad final de recubrimiento en consecuencia.

6) cuando la densidad de clonación en la placa es demasiado alta, debido a la desnutrición, el crecimiento de la clonación se ralentiza y las colonias se reducen. Para obtener grandes colonias, se debe reducir la cantidad de plásmidos.

7) el propósito de agregar rifampicina al medio de cultivo es prevenir el crecimiento de bacterias diversas y seleccionar agrobacterium; La adición de Chain meisu o qingda meisu de acuerdo con la resistencia de la CEPA utilizada puede evitar la pérdida de plásmidos ti, pero Chain meisu no es propicio para la operación transgénica de agrobacterium. en general, no se considera Chain meisu o qingda meisu en el cultivo de agrobacterium, porque la probabilidad de pérdida de plásmidos ti es extremadamente baja (básicamente insignificante).

8) para su seguridad y salud, Use ropa experimental y guantes desechables.

Modo de empleo

1) sacar la taza de descarga eléctrica de 0,1 cm y la tapa de la taza del líquido de almacenamiento y colocarla boca abajo sobre el papel de absorción de agua limpia durante 5 minutos, esperar a que se seque el agua y colocarla durante 5 minutos, para que el etanol se volatilice completamente, introducirla inmediatamente en el hielo, compactar la superficie del hielo, La parte superior de la taza de electrodos a 0,5 cm de la superficie del hielo para facilitar la tapa de la taza, y dejarla reposar en el hielo durante 5 minutos para enfriarla completamente.

2) tomar las células receptivas conservadas a - 80 ° C e introducirlas en el hielo durante 5 minutos, y esperar a que se derritan.

3) añadir 0,01 a 1 μg (no más de 6 μl de volumen) de ADN plasmídico a la suspensión celular receptora de 50 μl, perforar el Fondo del tubo con Bo de mano para mezclarlo bien e introducirlo inmediatamente en el Hielo. Después de soplar suavemente la pistola y mezclar las células receptivas - plasmídeos, se transfiere rápidamente a la taza de descarga eléctrica, se cubre la tapa de la taza y el tubo de aire se conserva para su uso [nota: debido a la alta eficiencia de conversión receptiva, di utiliza zuihao como ensayo previo para determinar la cantidad de plasmídeos de zuijia a la vez].

4) inicie el electrocardiógrafo y establezca los parámetros: C = 25 μf, PC = 200 ohm, v = 2400 V (este parámetro se refiere al bio - rad, para su uso específico, consulte los pasos recomendados del electrocardiógrafo para operar), coloque rápidamente la taza de descarga eléctrica en la ranura de transferencia eléctrica y complete la inserción rápida de la descarga eléctrica en el Hielo.

5) añadir 700 μl de LB sin antibióticos y transferirlo al tubo de aire receptivo, cultivar oscilantemente a 28 ° C durante 2 a 3 H.

6) centrifugar 6000rpm durante 1 minuto, dejar unos 100ul para limpiar, y luego soplar suavemente la suspensión pesada con una pistola. Luego agregue la tableta LB o Yeb que contiene los antibióticos correspondientes y extienda suavemente las células uniformemente con una barra de vidrio estéril. Se colocó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y después de que el líquido fue absorbido, se invirtió la tableta y se cultivó a 28 ° C durante 2 - 3 días. [nota: cuando la tableta solo contiene antibióticos vectoriales binarios utilizados para la transformación, se puede cultivar a 28 ° C durante 48 horas; Cuando se agrega un antibiótico vectorial dual a la tableta, se necesita un cultivo de 48 - 60h a 28 ° C cuando se agrega un antibiótico vectorial dual a la tableta; cuando se agrega un antibiótico vectorial dual a la tableta, se necesita un cultivo de 60 - 72h a 28 ° C cuando se agrega un antibiótico vectorial dual a la tableta; No se recomienda un cultivo de rifu de más de 20 μg / ML en la tableta o líquido.

7) cultivo líquido de clonación objetivo:

J pequeñas cantidades de sacudidas: añadir 1 ml de medio líquido LB que contenga los antibióticos correspondientes a un tubo de ensayo transpirable de fondo redondo de 15 ml, seleccionar 1 - 2 colonias individuales de la placa recién cultivada para vacunarse, 30 ° c, 200 RPM sacudidas 24 - 48 H.

K un gran número de sacudidas: añadir menos de 20 ml de medio de cultivo líquido LB que contenga antibióticos correspondientes en una botella triangular transpirable de 100 ml, tomar una pequeña sacudida y recoger las bacterias en una proporción del 2%, 30 ° c, 200 RPM sacudidas 24 - 48 H.

[nota] para Agrobacterium (bacterias aeróbicas), tanto las tabletas sólidas como las sacudidas líquidas requieren una gran cantidad de oxígeno. La clave del éxito de la sacudida líquida es garantizar que el medio de cultivo contenga suficiente oxígeno disuelto, que se puede controlar mediante los siguientes métodos: J con un tubo de ensayo transpirable o una botella triangular; K asegúrese de que la solución nutritiva tenga una gran sección transversal y un pequeño espesor; L los antibióticos se añaden lo menos posible o no, y los antibióticos que deben añadirse se se utilizan en la menor concentración posible.

Productos relacionados [serie de células receptivas]

Anexo 1 fórmulas de medios de cultivo LB sólidos y líquidos

Anexo 2 fórmulas de medios de cultivo Yeb sólidos y líquidos

Cuadro 3 Resumen de la sensibilidad de los Agrobacterium comunes a los antibióticos

- - written / edited by V. shallan [los derechos de autor pertenecen a mkbio maokang]

Shanghai maokang Biotechnology co., Ltd. es un servicio de reactivos, instrumentos y consumibles de laboratorio y experimentos involucrado en la investigación en las ciencias de la vida y la biotecnología, que se dedica principalmente a la biología celular, botánica, biología molecular, inmunología, bioquímica y proteómica. Campos como la investigación y el desarrollo y producción de biofarmacéuticos y reactivos de diagnóstico. La compañía se adhiere al concepto de negocio de "orientado a las personas, honesto y confiable en el contrato". Adherirse al principio de "garantía de calidad" para proporcionar productos de alta calidad a la mayoría de los clientes.