3t3 - L1 (fibroblasto embrionario de ratón)

Métodos de conservación celular:

(1) Criopreservación celular

1. preparar un medio de cultivo congelado que contenga 10% Dmso o glicerina y 10 a 20% de suero de ternera;

2. tome el número de células en crecimiento, elimine el medio de cultivo antiguo y limpie con pbs.

3. eliminar el PBS y agregar una cantidad adecuada (cubriendo la superficie de la placa de petri) para digerir las células que crecen en una sola capa;

4. centrifugación 1000 rpm, 5 min;

5. eliminar, añadir una cantidad adecuada de medio de cultivo de liofilización preparado, soplar suavemente con una pajita para que las células sean uniformes, contar y ajustar la densidad final de las células en el liofilizado a 5 × 106 / ML a 1 × 107 / ml;

6. dividir las células en un criodepósito, de 1 a 1,5 ml por tubo;

7. marque el nombre de la célula, el tiempo de congelación y el operador en el congelador;

8. almacenamiento congelado: el procedimiento estándar de almacenamiento congelado es la tasa de enfriamiento - 1 ~ - 2 ℃ / min; Cuando la temperatura alcanza por debajo de - 25 ℃, puede aumentar a - 5 ℃ ~ - 10 ℃ / min; A - 100 ℃, se puede sumergir rápidamente en nitrógeno líquido. También se puede poner el congelador que contiene células en el refrigerador - 20 ℃ durante 2h, y luego ponerlo en el refrigerador - 70 ℃ durante la noche, sacar el congelador y trasladarlo al contenedor de nitrógeno líquido.

Información del producto:

Introducción al producto:

Pasos de operación:

1) cambiar la mitad o la cantidad completa del medio de cultivo 24 - 48 horas antes de la congelación para que la célula se encuentre en un período de crecimiento exponencial.

2) preparación de una solución de Criopreservación (preparación antes de su uso): tomar otro tubo centrífuga, añadir medio de cultivo, suero y añadir Dimetilsulfóxido (dmso) gota por gota a una concentración del 20%, es decir, hacer un Criopreservación doble y colocarlo a temperatura ambiente para su uso.

3. recoger las células cultivadas por centrifugación, volver a colgar las células con un medio de cultivo con suero y tomar una pequeña cantidad de suspensión celular (aproximadamente 0. 1 ml) contando la concentración celular y la tasa de supervivencia antes de la congelación.

4) tomar la cantidad de liofilización igual a la suspensión celular, añadir lentamente la suspensión celular gota a gota y sacudir el tubo de ensayo para hacer la suspensión liofilizada celular (la concentración después de Dmso es del 5 al 10%), de modo que la concentración celular es de 1 a 5 × 106 células / ml, mezclar uniformemente, EMPACARLA en el tubo de Criopreservación marcado, 1 a 2 ml / vial, y tomar una pequeña cantidad de suspensión celular para la detección de contaminación. Después de un cierre estricto, indique el nombre de la célula, el álbum y la fecha. Luego se congela.

Precauciones:

1. las células que deben congelarse deben crecer bien y tener una alta tasa de supervivencia, con una densidad de alrededor del 80% al 90%. Para detectar si las células conservan su naturaleza antes de la congelación, se debe probar si hay producción de anticuerpos uno o dos días antes de la congelación.

2) las células pueden congelarse durante mucho tiempo en nitrógeno líquido sin afectar la vitalidad celular; Se puede conservar a - 70 grados durante varios meses.

3. preste atención a la calidad del protector de congelación. El Dmso debe ser de grado reactivo, estéril e incoloro (0. 22 micron fglp telfilon filtra o compra directamente productos estériles, como Sigma D - 2650), se empaqueta en pequeños volúmenes de 5 a 10 ml, se conserva a 4 ° C para evitar la luz y no se descongela varias veces. Glycerol también debe ser de grado reactivo y conservarse protegido de la luz después de la esterilización a vapor de alta presión. Se usa dentro de un año después de su apertura, ya que puede ser tóxico para las células después de un almacenamiento prolongado. En este método, se prepara primero un liofilizado doble, que puede evitar el daño celular causado por el calor liberado cuando se agrega directamente dmso. La adición lenta de la suspensión celular gota a gota hace que la célula se adapte gradualmente a la hiperosmosis y puede reducir el daño celular. Dmso puede causar la diferenciación de algunas líneas celulares de leucemia, que se pueden congelar con glicerina al 10%.

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