Detección de la eficacia antiinflamatoria in vitro de los cosméticos

Detección de la eficacia antiinflamatoria in vitro de los cosméticos

Principios de detección y construcción de modelos experimentales

La detección de la eficacia antiinflamatoria in vitro de los cosméticos se basa en un modelo de inflamación de macrófagos inducida por lps, que evalúa la inhibición de los sujetos sobre la liberación de factores inflamatorios simulando procesos fisiopatológicos de la respuesta inflamatoria cutánea. El experimento seleccionó el macrófagos mononuclear de ratón RAW 264.7 como célula modelo, que puede activar la vía de señalización NF - kb estimulada por LPS y secretar una gran cantidad de mediadores inflamatorios como el óxido nítrico (no), la IL - 6 y el factor de necrosis tumoral alfa (tnf - alfa), cuyos niveles de Liberación están positivamente relacionados con el grado de inflamación.

Parámetros clave para la construcción del modelo:

Densidad de vacunación celular: 5 × 10 células / agujero (96 placas de agujero)

Concentración de estimulación de lps: 1 μg / ML (sigma - Aldrich l2630)

Tiempo de tratamiento del sujeto: estimulación combinada con LPS 24 horas después del pretratamiento durante 2 horas

Control positivo: disai misong (1 μmol / l, tasa de inhibición ≥ 80%)

El experimento requiere cinco gradientes de concentración (0,01% - 1%) y un grupo de control en blanco para verificar la tasa de supervivencia celular superior al 80% a través del método MTT para garantizar que los resultados de la prueba no se vean perturbados por la citotoxicidad.

Indicadores básicos de detección y verificación metodológica

Determinación de la liberación de óxido nítrico (no)

El contenido de nitrito del metabolito no en el líquido cefalorraquídeo celular se detectó cuantitativamente mediante el método colorimétrico del reactivo griess (sigma - Aldrich g4410). El proceso de detección incluye:

Preprocesamiento de la muestra: se toma un sobrenadante celular de 50 μl y se mezcla con un reactivo griess de volumen igual

Condiciones de incubación: 37 ° C para evitar la reacción de la luz durante 15 minutos

Instrumento de detección: detector enzimático (thermo multiskan fc) determinación de la absorción a 540 nm de longitud de onda

Método de cálculo: la concentración de no se calculó con la curva estándar de ácido hiao sódico (0 - 100 μmol / l), tasa de inhibición inflamatoria = (promedio del Grupo modelo - promedio del Grupo de prueba) / (promedio del Grupo modelo - promedio del Grupo en blanco) × 100%

Requisitos de verificación metodológica: curva estándar R m2 > 0,99. precisión intradía RSD inferior al 5%, tasa de recuperación del 90% al 110%.

Detección de niveles de factores inflamatorios (il - 6 / TNF - alfa)

Se utiliza el método Elisa de doble sándwich de anticuerpos (kit de sistemas R & d), y los parámetros específicos son los siguientes:

Rango de detección de IL - 6: 7,8 a 500 pg / ml, límite máximo de detección de di 3,9 pg / ML

Rango de detección del TNF - alfa: 15,6 a 1000 pg / ml, límite máximo de detección di de 7,8 pg / ML

Pasos de operación: dilución de la muestra → incubación de la muestra → lavado de la placa → Unión de dos resistencias estándar enzimáticas → desarrollo de color (sustrato tmb) → terminación de la reacción (2mol / L h₄ so) → lectura de 450 nm

Requisitos de datos: los niveles de IL - 6 / TNF - alfa en el Grupo de prueba disminuyeron en ≥ 30% en comparación con el Grupo modelo, y la diferencia fue estadísticamente significativa (prueba t de muestra independiente, p<0.05)

Base estándar y sistema de control de calidad

Todo el proceso de prueba sigue estrictamente los "métodos de prueba in vitro irritantes / corrosivos de la piel" de la OCDE TG 442e (2018) y los "métodos de prueba de irritación de modelos de piel 3D in vitro de cosméticos" GB / T 35892 - 2018. Las medidas clave de control de calidad incluyen:

Certificación de línea celular: células RAW 264.7 identificadas con Str (atcc TIB - 71), el número de descendientes se controla dentro de la generación 20

Trazabilidad del reactivo: actividad de LPS ≥ 1 × 10 ⁶ UE / mg, coeficiente de variación intralote del kit de Elisa inferior al 10%

Control ambiental: incubadora de CO2 (37 ° C ± 0,5 ° c, 5% de co2), Mesa de trabajo ultralimpia (clase ISO 5)

Validez de los datos: 3 agujeros compuestos por concentración, 3 repeticiones del experimento, coeficiente de variación dentro del Grupo inferior al 15%

Proceso de detección y criterios de determinación de resultados

Proceso experimental completo

Preparación celular: reanimación de células RAW 264,7, cultivo de paso con medio de dmem que contiene 10% de suero bovino fetal

Tratamiento del sujeto: diluir la muestra cosmética con un medio de cultivo a la concentración establecida y esterilizarla con una membrana filtrante de 0,22 micras

Inducción inflamatoria: añadir LPS (concentración final de 1 μg / ml) para estimular durante 24 horas, recoger el líquido sobrenadante celular

Detección de indicadores: determinación simultánea de no (método griess) e il - 6 / TNF - alfa (método elisa)

Análisis de datos: análisis estadístico con graphpad Prism 9.0 para calcular el valor IC

Criterios para determinar los resultados

Nota: para determinar la potencia, es necesario cumplir con la tasa de inhibición de no ≥ 50% y la tasa de inhibición de IL - 6 / TNF - alfa ≥ 40%.

Capacidad técnica del mecanismo de detección

El Laboratorio de pruebas de zhongke tiene la calificación reconocida de CNAS (número de certificado CNAS l2206) y tiene una plataforma técnica perfecta para pruebas antiinflamatorias in vitro, que incluye:

Sistema de detección multifactorial: luminex xmap 200 (se pueden detectar 10 factores inflamatorios al mismo tiempo)

Imagero de alta connotación: perkinelmer opereta CLS (análisis morfológico celular)

Estación de trabajo automatizada: Beckman biomek 4000 (preprocesamiento de muestras)

El Laboratorio ha completado más de 500 lotes de proyectos de pruebas antiinflamatorias cosméticas en los últimos tres años, cubriendo cremas, esencias, máscaras faciales y otras formas de dosificación, con una tasa de aprobación de datos del 92,3%. El caso típico muestra que un extracto calmante que contiene extracto de Portulaca oleracea inhibe el 62,7% de no y el 58,3% de IL - 6 a una concentración del 0,5%, todos superiores a la media de la industria (41,2% de no).

Escenarios de aplicación y valor de la industria

Las pruebas antiinflamatorias in vitro se utilizan principalmente para verificar la eficacia de los cosméticos de reparación muscular sensible, antipox y reparación posterior al sol, y pueden proporcionar el siguiente apoyo técnico a las empresas:

Optimización de la fórmula: selección de la cantidad máxima de adición de Jia de ingredientes activos antiinflamatorios (como centella asiatica, mirra roja)

Cumplimiento declarado: cumplir con los requisitos de detección de la eficacia "calmante" en el Código de evaluación de la eficacia cosmética

Competencia en el mercado: mejorar la competitividad del producto a través de datos de pruebas de terceros, como una marca internacional que aumenta la prima del producto en un 20% a través de esta prueba

Con la mejora de los requisitos de Seguridad cosmética de los consumidores, las pruebas antiinflamatorias in vitro se han convertido en el proyecto central de la evaluación de la eficacia. El laboratorio sugiere que las empresas introduzcan esta prueba en la etapa de desarrollo del producto y formen una cadena completa de pruebas en combinación con la prueba de manchas humanas, lo que no sólo garantiza el cumplimiento del producto, sino que también mejora la confianza del mercado.