Prueba de promoción de la síntesis de colágeno in vitro de cosméticos

Prueba de promoción de la síntesis de colágeno in vitro de cosméticos

Principios de detección y caminos técnicos

El colágeno es el componente central para mantener la elasticidad de la piel, y su capacidad sintética afecta directamente la función antiarrugas y reparadora de la piel. La prueba de promoción de la síntesis de colágeno in vitro de cosméticos evalúa el efecto estimulante de los sujetos sobre la biosíntesis de colágeno mediante el establecimiento de un modelo de cultivo de fibrocitos que simula el entorno fisiológico de la corteza cutánea. El sistema de detección, en el que se estudiaron los dermatólogos humanos (hdf) o las líneas de fibroblastos inmortalizados (como el nhdf), se sometió a condiciones de cultivo estandarizadas (37 ° c, 5% de co2, 95% de humedad) y se sometió al pronóstico seco de la muestra para verificar doblemente los cambios en la capacidad de síntesis de colágeno a partir de niveles proteicos y genéticos.

El diseño experimental utilizó el método de gradiente de concentración (generalmente se establecen tres grupos de dosis del 0,01%, 0,1% y 1%), y se establecieron simultáneamente controles en blanco (medio libre de suero) y controles positivos (visheng C 100 μmol / l) para garantizar la comparabilidad y fiabilidad de los resultados. Los principios técnicos clave se basan en que los fibrocitos, estimulados por principios activos, promueven la secreción de colágeno tipo I activando la vía de señalización TGF - beta / smad, aumentando la expresión del gen col1a1. La detección requiere una verificación simultánea de la Citotoxicidad (método mtt), que requiere que la tasa de supervivencia celular del sujeto sea superior al 80% a una concentración efectiva, eliminando la interferencia de la proliferación celular o la toxicidad en los resultados de la detección.

Métodos de detección básicos y procesos estandarizados

Cuantificación de los niveles de proteínas: determinación del contenido de colágeno tipo I por Elisa

La concentración de colágeno tipo I (col1) en el sobrenadante de cultivo celular se detectó específicamente mediante el método de inmunoabsorción enzimática (elisa), y el proceso de operación siguió estrictamente las especificaciones técnicas de la Guía de prueba de eficacia del modelo de piel 3D in vitro cosmético GB / T 35828 - 2018. Los pasos específicos incluyen:

Pretratamiento de la muestra: recoger el líquido sobrenadante celular intervenido durante 72 horas y centrifugar a 4 ° C 12000 RPM durante 10 minutos para eliminar las impurezas;

El paquete de anticuerpos: 96 paquetes de placa de agujero fueron diluidos con anticuerpos monoclonales contra la col1 humana en ratones (1: 1000), incubados a 4 ° C durante la noche;

Unión de antígenos: añadir muestras y estándares diluidos por gradiente (0 - 200 ng / ml) e incubar a 37 ° C durante 2 horas;

Reacción de color: añadir el sustrato de resistencia secundaria marcado por HRP (diluido 1: 2000) y tmb a su vez, y determinar la absorción a una longitud de onda de 450 nm después de terminar la reacción;

Cálculo de datos: la concentración de col1 se convirtió a través de la curva estándar, y la tasa de síntesis relativa se calculó en comparación con el grupo control en el Grupo experimental, lo que requiere que el contenido de col1 en el Grupo de resultados positivos aumente en ≥ 20% en comparación con el control en blanco (p < 0,05).

Verificación del nivel genético: PCR en tiempo real para detectar la expresión col1a1

Para revelar el mecanismo molecular de la síntesis de colágeno, es necesario utilizar la PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (qpcr) para detectar cambios en el nivel de transcripción del gen col1a1. el proceso experimental es el siguiente:

Extracción total de arn: el método triazol divide las células y nanodrop determina la concentración de ARN (a260 / A280 relación 1,8 - 2,0);

Reacción de transcripción inversa: síntesis de adnc con kit de rt primeshcript, las condiciones de reacción son de 37 ° C durante 15 minutos y 85 ° C durante 5 segundos;

Amplificación qpcr: con gapdh como gen de referencia interna, la secuencia de primer col1a1 fue f: 5 '- gaggccaagaagagacatc - 3', r: 5 '- cagatccatcgcaac - 3', amplificada en el sistema lightcycler 480 (95 ° c predesnaturalización durante 10 minutos, 40 ciclos: 95 ° C 15 segundos, 60 ° C 30 segundos);

Análisis de los resultados: la expresión relativa de col1a1 se calculó utilizando el método 2.. - △ Ct. los sujetos positivos tuvieron que aumentar la expresión génica ≥ 1,5 veces, lo que fue consistente con la tendencia de cambio de los niveles de proteínas.

Criterios de control de calidad y determinación de resultados

Control de calidad del sistema experimental

Garantía de calidad celular: utilizando células de crecimiento logarítmico de generación 3 - 10, la densidad de vacunación se controla en 5 × 10 células / CM cuadrados para garantizar que la tasa de adhesión celular sea superior al 90%;

Estandarización de reactivos: el suero bovino fetal debe pasar la prueba de micoplasma, la concentración de la enzima dan blanca en el páncreas se controla estrictamente en el 0,25% y la adición de EDTA en el 0,02%;

Requisitos de precisión del instrumento: fluctuación de temperatura de la incubadora de CO2 ≤ 0,1 ° c, pH de mantenimiento de 7,2 - 7,4. la Mesa de trabajo súper limpia debe alcanzar la limpieza de nivel 5 de la norma ISO (partículas suspendidas ≤ 3520 / M 3);

Verificación metodológica: la precisión intralote RSD del método Elisa es inferior al 8%, la precisión entre lotes RSD es inferior al 12%, y la tasa de recuperación es del 90% al 110%; La eficiencia de amplificación de qpcr es del 90% al 110%, y el coeficiente de correlación R m2 > 0,99.

Umbral de decisión de resultados

Criterios básicos de determinación: el sujeto se puede determinar positivo a una concentración no citotóxica (tasa de supervivencia superior al 80%) si se cumple alguna de las siguientes condiciones:

El contenido de colágeno tipo I aumentó en ≥ 20% en comparación con el control en blanco (método elisa, p<0.05);

Aumento ≥ 1,5 veces de la expresión del gen col1a1 (método qpcr, p<0.05)。

Requisitos de verificación reforzados: para los productos que afirman "promover significativamente la síntesis de colágeno", es necesario cumplir con un aumento de los niveles de proteínas ≥ 30% y un aumento de los niveles genéticos ≥ 2 veces, y proporcionar al menos tres datos duplicados de experimentos independientes.

Ventajas técnicas y garantía de cumplimiento de las instituciones de Inspección

Instalaciones de hardware y capacidades técnicas

El Centro de pruebas de zhongke está equipado con un laboratorio de bioseguridad de tres niveles, y el equipo central incluye:

Sistema de cultivo celular totalmente automático (thermo Science heracell vios): realizar el monitoreo en tiempo real y la alarma de la temperatura y la concentración de co2;

Estación de trabajo Elisa de alto rendimiento (biotek 800ts): admite la detección simultánea de 96 muestras, con un límite de detección tan bajo como 0,1pg / ml;

PCR cuantitativo fluorescente (roche lightcycler 96): equipado con un módulo de elevación rápida de la temperatura, un solo experimento se puede completar en 2 horas;

Sistema de imágenes celulares (olympus ix73): análisis cuantitativo de la intensidad de la inmunofluorescencia del colágeno en combinación con el software imagej.

Calificación de Quan Wei y credibilidad de los datos

El laboratorio aprueba la acreditación CNAS (número de certificado CNAS l2206) y la calificación cma, y el proceso de prueba se sigue estrictamente:

Norma nacional: GB / T 35828 - 2018 guía de prueba de modelos de piel in vitro cosméticos;

Especificaciones internacionales: OCDE TG 439 "prueba de irritación cutánea in vitro", ISO 10993 - 5 "prueba de citotoxicidad";

Guía de la industria: Centro de revisión de cosméticos de China "principios rectores para la evaluación de la Declaración de eficacia cosmética" (edición 2021).

Servicios de detección personalizados

Soporte técnico de cadena completa para diferentes tipos de cosméticos:

Selección de materias primas: cribado de actividad in vitro de extractos vegetales, péptidos y otros ingredientes activos para acortar el ciclo de investigación y desarrollo;

Optimización de la fórmula: evaluar el impacto de los conservantes y sabores en la actividad sintética del colágeno y optimizar el esquema de mezcla;

Verificación de estabilidad: 28 días de almacenamiento a 4 ° c, 25 ° C y 40 ° C para monitorear el impacto de la degradación de los ingredientes activos en la eficacia;

Servicio de valor agregado de datos: proporciona interpretación de datos en profundidad, como el análisis de la vía genética col1a1 y el cálculo del principio activo ic50 / ec50.

Aplicaciones de la industria y casos típicos

Una esencia antienvejecimiento fue verificada por este sistema de detección, lo que mostró que después de 48 horas de intervención en el Grupo de concentración del 1%, la secreción de col1 de los fibrocitos aumentó en un 42,3% en comparación con el control en blanco (p < 0,01), la expresión de arnm col1a1 aumentó 2,1 veces y la tasa de supervivencia celular alcanzó el 91,7%. Los datos apoyan con éxito su eficacia de "promover la síntesis de colágeno", afirmando que los informes de prueba relevantes fueron reconocidos por la administración estatal de drogas Jian como base para el registro. La práctica ha demostrado que las pruebas estandarizadas de síntesis de colágeno in vitro pueden reemplazar eficazmente los experimentos tradicionales con animales, al tiempo que garantizan la precisión de las pruebas, reducen considerablemente los costos de investigación y desarrollo y las disputas éticas, y proporcionan un apoyo técnico científico y confiable para la evaluación de la eficacia cosmética.